Cơ chế RNAi; ứng dụng RNAi trong điều trị bệnh và thuốc RNAi

Theo học thuyết trung tâm của sinh học phân tử: DNA sao chép sau đó phiên mã tạo ra mRNA và từ mRNA dịch mã tạo ra protein. Trong các quá tr...

Theo học thuyết trung tâm của sinh học phân tử: DNA sao chép sau đó phiên mã tạo ra mRNA và từ mRNA dịch mã tạo ra protein. Trong các quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã đều có sự tham gia của các loại RNA khác nhau với nhiều vai trò khác nhau. Ví dụ như: mRNA đóng vai trò truyền đạt thông tin di truyền
Tham gia quá trình dịch mã có tRNA và rRNA RNA với vai trò xúc tác : ribozyme
Điều hoà biểu hiện gene: RNAi






Slide 3










Slide 4
I.          Giới thiệu
Theo học thuyết trung tâm của sinh học phân tử: DNA sao chép sau đó phiên mã tạo ra mRNA và từ mRNA dịch mã tạo ra protein. Trong các quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã đều có sự tham gia của các loại RNA khác nhau với nhiều vai trò khác nhau. Ví dụ như: mRNA đóng vai trò truyền đạt thông tin di truyền
Tham gia quá trình dịch mã có tRNA và rRNA RNA với vai trò xúc tác : ribozyme
Điều hoà biểu hiện gene: RNAi
Cơ thể con người chứa rất nhiều loại tế bào khác nhau. Trong mỗi tế bào ko phải tất cả các gen đều được biểu hiện, mỗi loại tế bào sẽ biểu hiện gen khác nhau. Các tế bào thần kinh biểu hiện gen khác với các tế bào cơ hoặc tế bào gan. Đối với việc phân chia tế bào, nhân đôi DNA thì có các điểm kiểm soát ở các giai đoạn G1, G2 và S. Đối với gen, gen nào hoạt động ở thời điểm nào được điều chỉnh bởi các yếu tố điều hòa biểu hiện gen, có điều hòa biểu hiện gen trước phiên mã và sau phiên mã. Quá trình điều hòa sau phiên mã có sự tham gia của RNAi.
“RNA can thiệp” (RNAi) giúp kiểm soát các gen đang hoạt động. Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gen có trình tự bổ sung với nó thông qua việc ức chế dịch mã, phân giải mRNA. Việc điều hòa biểu hiện gen của RNAi gồm nhiều thành phần
tham gia nên nó là một hệ thống bên trong các tế bào.


Slide 5










Slide 6


















Slide 7
Bên cạnh chức năng điều hòa biểu hiện gen, RNAi còn có vai trò trong bảo vệ tế bào chống lại gen ký sinh, virus và gen nhảy (transposon). Điều này là do RNAi sử dụng chính trình tự nucleotide để tắt gen (im lặng), dẫn tới khả năng kháng được cả acid nucleotide nội sinh và acid nucleotide bên ngoài.
Ví dụ khi virus xâm nhiễm vào tế bào, chúng giải phóng genome bộ gen của chúng để xâm nhiễm hệ thống RNAi sẽ ức chế, phân cắt chúng trước khi genome của chúng tích hợp vào bộ gen của tế bào chủ.
RNAi có 2 loại là miRNA và siRNA.
Lịch sử phát triển RNAi
1990 Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R quan sát thấy hiện tượng ức chế lẫn nhau giữa mRNA nội sinh và biến đổi gen từ thí nghiệm tạo ra petunias với màu tím đậm hơn. Hiện tượng ức chế đồng thời được gọi là sự im lặng gen sau phiên mã (PTGS)
1995 Guo S, and Kemphues K J nhận thấy anti-senseRNA có hiệu quả trong việc ức chế sự biểu hiện của gen par-1 trên loài C. Elegans. Họ tiêm anti-senseRNA vào C.elegans để làm im lặng gen. Mặc dù kiểm soát âm của họ cũng cho thấy sự ức chế gen trung gian, nhưng nó vẫn là một phát hiện đáng chú ý.
1998 Fire et al mô tả quá trình can thiệp RNA ở C,elegans. Họ không chỉ sử dụng sense or anti-senseRNA mà còn sử dụng cả dsRNA để kìm hãm sự biểu hiện của gen trong C.elegans. Thí nghiệm này cho thấy việc dùng dsRNA để im lặng gen hiệu quả hơn việc chỉ dùng sense or anti-senseRNA 10 lần. Qui trình này đưa ra kỷ nguyên RNAi.
2000 Zamore et al khám phá qui trình sử dụng enzyme Dicer để cắt các đoạn dsRNA dài thành các đoạn nhỏ trong Drosophila
2001 Elbashir S M et al. Lần đầu tiên mô tả sự hiện diện của RNAi trong tế bào động vật hữu nhũ. Rất khó để thực hiện được RNAi trong tế bào động vật có vú vì phản ứng interferon mạnh gây ra bởi dsRNA dẫn đến ức chế sự biểu hiện toàn bộ gen hoặc gây chết tế bào. Cuối cùng họ cũng tìm được cách phân hủy các mRNA trình tự đặc biệt mà không cảm ứng đáp ứng mạnh của interferon bằng cách đưa vào các đoạn mạch đôi 20-21nt gọi là siRNA. Hiện nay, các nghiên cứu này như là một công cụ mạnh để kìm hãm một gen mong muốn trong động vật hữu nhũ nhanh chóng và chọn lọc.
2002 McCaffrey et al. cho thấy sự ức chế biểu hiện của gen, trong chuột trưởng thành bằng siRNA và RNA kẹp tóc nhỏ được sao chép từ DNA (miRNA). Khả năng sử dụng kỹ thuật này cũng được đề cập đến bằng cách chứng minh có hiệu quả nhắm mục tiêu của một trình tự từ virus viêm gan C do can thiệp RNA in vivo.
2003 Paddison, Sui, Paul et al. nhận thấy rằng RNA kẹp tóc ngắn hoạt động như dsRNA và







Slide 8




Slide 9















Slide 10














Slide 11
có thể gây ra sự im lặng của trình tự đặc hiệu ở động vật có vú.
2003 Song et al. báo cáo rằng ARN can thiệp nhỏ có thể được sử dụng điều trị ở động vật có vú.
Chỉ trong vòng khoảng 15 năm nghiên cứu về RNAi thì vào năm 2004 Acuity Pharmceuticals đã thử nghiệm lâm sàng về thuốc siRNA cho bệnh thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi tác (AMD)
2006 Giải Nobel sinh lý và y học được trao cho hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello về việc khám phá ra cơ chế RNAi – im lặng gen bởi RNA sợi đôi (dsRNA)
Thí nghiệm của Andrew và Craig.
Hính 1: Đưa các phân tử mRNA (sợi sense) mã hoá một protein cơ, kết quả cho thấy không làm thay đổi hành vi của giun tròn. Tương tự như khi tiêm antisense cũng không tháy hiện tượng gì. Nhưng khi Fire và Mello tiêm cả sợi đôi của RNA này vào cơ thể giun tròn, thấy giun có những chuyển động lạ, cụ thể là co giật.
Các hành vi tương tự cũng xảy ra ở những con giun đã knock out gen chịu trách nhiêm tạo protein cơ.
Hình 2. RNAi ảnh hưởng lên hàm lượng mRNA mex-3 trong phôi. Mex-3 mRNA có rất nhiều trong tuyến sinh dục và phôi sớm Sau khi tiêm RNA mex-3 mạch đơn hoặc mạch đôi một vào tuyến sinh dục C. Elegans. Các mRNA bị mất sau khi tiêm RNA kép, trong khi tiêm RNA antisense chỉ làm giảm mRNA đến một mức độ nào đó kết quả được thể hiện qua mức độ màu, màu càng đậm phản ánh lượng mRNA hiện diện càng nhiều.
II.        Cơ chế Môt số thuật ngữ miRNA: micro RNA
siRNA: small 3nterfering RNA Guide strand: antisense strand Passenger strand: sense strand
RISC: RNA – incluced silencing complex (phức hệ tắt gene cảm ứng bởi RNA) Dicer: Rnase III
Drosha: RNAse III
Ago: ARGONAUTE, họ protein kết hợp với các sRNA bao gồm siRNA và miRNA, có khối lượng phân tử 95 tới 100kDa.
Cơ chế chung của RNAi
Trong tế bào chất các dsRNA bị Dicer cắt thành các đoạn nhỏ
" Các đoạn dsRNA nhỏ này gắn với một phức hợp protein










Silde 12
" Một mạch RNA bị loại bỏ, mạch còn lại kết hợp với phức hợp protein tạo thành RISC
" RISC dùng mạch RNA còn lại như là mẫu dò để gắn với một phân tử mRNA đích – (có trình tự bắt cặp bổ sung mạch RNA).
" Phân tử target mRNA bị tách mạch và bị phân hủy.
" ko có sự hình thành protein
" Gen bị im lặng (tắt)
1.      Con đường siRNA – RNA nhỏ can thiệp (small interfering RNA)
+ Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma)
+ Cơ chế này cho phép các sinh vật can thiệp vào trình tự gen ngoại lai trước khi nó có thể tích hợp vào bộ gen của vật chủ và phá hủy nó
+ dsRNA (double strand RNA) ngoại lai sẽ bị Dicer (và DGCR 8) cắt thành những đoạn mạch đôi nhỏ từ 20 – 25 nu với 2 nucleotide ở đầu 3’ nhô ra gọi là siRNA(có kích thước thích hợp để nạp vào protein Argonaute)
" Tiếp theo, dsRNA được mang đến Argonaute, nhờ phức hợp các protein
(Phức hợp này gồm Dicer, Argonaute, dsRBP – làm nhiệm vụ cắt dsRNA và mang nó đến Argonaute )
" Ở đây xảy ra quá trình chọn mạch, một mạch của mạch đôi gắn với Argonaute, mạch kia bị phân hủy. (mạch bị phân hủy là passenger strand, mạch được giữ lại là guide strand)
" Argonaute gắn với RNA guide strand " RISC (RNA-induced silencing complex)
RISC sử dụng RNA guide strand như mẫu dò để gắn với mRNA đích có trình tự bổ sung với RNA guide strand
" phân hủy mRNA " ngăn cản quá trình dịch mã
2.      Con đường miRNA (micro RNA)
+ Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear) và trong tế bào chất (cytoplasma)
+ Các phân tử miRNA có nguồn gốc từ các phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA) được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene bên trong nhân tế bào, các phân tử này có chứa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin);
" Các phân tử pri-miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre-miRNA, dài khoảng 65 – 70nu " phân tử tiền microRNA;
" Các phân tử Pre- miRNA sẽ được Exportin-5 di chuyển ra ngoài tế bào chất;
" Pre- miRNA sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất
" enzyme Dicer cắt thành những đoạn dsRNA nhỏ (khoảng 19 – 21 nu); Giống như con đường siRNA,











Slide 13





























Slide 14
" dsRNA được mang đến Argonaute, nhờ phức hợp các protein
" Xảy ra quá trình chọn mạch, một mạch của mạch đôi gắn với Argonaute, mạch kia bị phân hủy.
" Argonaute gắn với ssRNA " RISC (RNA-induced silencing complex)
" RISC gắn với mRNA đích (đang dịch mã)
" Phân hủy mRNA đích
" Kìm hãm quá trình dịch mã
Các cơ chế ức chế qua trung gian miRNA – phức hợp miRISC
Khi miRISC (phức hợp cảm ứng im lặng gen qua trung gian miRNA) chưa gắn vào mRNA các nhân tố khởi sự phiên mã và các tiểu phần của ribosome được huy động đến mRNA để khởi sự quá trinh dịch mã (hình trên cùng)
Khi miRISC gắn vào mRNA, quá trình dịch mã bị kìm hãm bằng một số cách (các hình bên dưới)
+ Ngăn cản quá trình gắn cap
+ Ngăn cản tiểu phần 60S của ribosome, nhân tố phiên mã eIF6 gắn vào mRNA
+ Khử đuôi poly A
+ Làm cho ribosome sớm rời khỏi mRNA
+ Phân hủy mRNA bằng cách khử đuôi poly A sau khi khủ cap
- dsRNA: các RNA mạch đôi có đầu 3’ nhô ra 2 nu
+ Cấu tạo nhô ra không làm thay đổi kích thước sản phẩm phân cắt, trình tự nucleotide đóng vai trò quyết định hiệu quả của Dicer.
+ Cấu trúc nhô ra có chứa C và A ở vị trí gần cuối và vị trí cuối (tương ừng) được xử lý hiệu quả nhất, trong khi những cấu trúc có chứa A ở vị trí gần cuối và U ở vị trí cuối là những chất ít tối ưu.
+ Số lượng nucleotide ở phần nhô ra là một yếu tố quan trọng trong độ đặc hiệu Dicer
+ Dicer sử dụng đầu 3’ nhô ra để đếm vị trí cắt dsRNA, thành các đoạn nhỏ, nhưng nế đầu nhô ra vượt quá 3 nu, Dicer không còn sử dụng đầu 3’ nhô ra để xác định vị trí cắt
" có ý nghĩa đối với thiết kế siRNA và shRNA. Các thành phần tham gia cùng RNAi
Phức hợp Microprocessor gồm Drosha và DGCR8
a.  Cấu trúc các vùng của phức hợp vi xử lý người gồm Drosha và DGCR8. Các vùng có nhiều proline (P), arginine và serine (R + S), hoặc tryptophan (W) được đánh dấu.
b.  Cấu trúc tinh thể của lõi DGCR8 .
DGCR8 có 2 vùng gắn với dsRNA (dsRBD1,2), chịu trách nhiệm cho việc xác định vị trí cắt






Slide 15











Slide 16








Slide 17














Slide 18
của Drosha, cố định dsRNA, chỉ tương tác với dsRNA, ko tương tác với ssRNA DGCR8 (Pasha ở đv ko xương sống) nhận ra điểm giao giữa thân pri-RNA và loop, và ssRNA " giúp Drosha xác định vị trí cắt, 11 bp từ junction " pre-RNA 65 – 70 nu
Dicer: là một endoribonulease trong họ Rnase III (class 3), có chức năng cắt dsRNA và pre- miRNA thành những đoạn dsRNA ngắn gọi là siRNA, dài khoảng 20 – 25 nucleotide. Dicer xúc tác bước đầu tiên trong con đường RNAi và khởi đầu sự hình thành RNA-induced silencing complex.
+ Các vùng cấu trúc của Dicer
+ Cấu trúc chung của Dicer người.
+ Vùng PAZ: Vùng PAZ chịu trách nhiệm nhận biết đầu 3’ nhô ra 2 nu của guide strand , có vai trò trong tách mạch
+ Vùng helicase định hướng dsRNA tới trung tâm hoạt động Rnase IIIa / b và vùng PAZ
RNA- induced silencing complex (RISC)
RISC-loading complex là một phức hợp gồm Argonaute + Dicer + dsRBP (dsRNA-binding protein) – TRBP (TAR RNA-binding protein), trong đó quan trọng nhất là Argonaute.
Có vai trò vận chuyển dsRNA đến RISC.
TRBP (TAR RNA-binding protein): có hai vùng gắn với dsRNA
Dicer gắn với TRBP để tăng cường hiệu quả vận chuyển dsRNA (đã được xử lý bởi Dicer) đến Argonaute.
Chức năng quan trọng của Argo là nhận ra guide strand, tách mạch mRNA đích, huy động các protein cho việc im lặng gen.
Gồm các vùng N-terminal, PAZ, MID, PIWI
Vùng PAZ chịu trách nhiệm nhận biết đầu 3’ nhô ra 2 nu của guide strand, giống vùng PAZ của Dicer; neo giữ đầu 3’ nhô ra 2 nu của guide strand. Ít có ái lực với đầu 5’của nhiều dsRNA trong RNAi.
Đầu 5’ của guide strand (nằm giữa MID và PIWI) được giữ bởi 1 túi (poket) giữa vùng MID và vùng PIWI, (giống như điểm neo giữ DNA của protein). Mở ra “vùng hạt giống” 2-8 nuc trên siRNA guide, để ghép cặp base với mRNA đích bổ sung. Sự kết hợp bổ sung thường xảy ra ở vùng hạt giống (2-7 nuc của đầu 5 ‘) của miRNA và UTR 3’ của mRNA đích, cắt tại vị trí giữa nuc 10 và nuc 11.
Sự khác nhau giữa miRNA và siRNA













Slide 19



Slide 20








Slide 21


miRNA
siRNA

Vị trí hình thành
Trong nhân và tế bào chất
Tế bào chất
Nguồn gốc
Tiền miRNA (Pre-miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng (stem-loop) hay dạng
kẹp tóc (hairpin)
Từ dsRNA có cấu trúc là chuỗi xoắn kép
Chiều dài
19 – 25 nu
21 – 22 nu
Bắt cặp bổ sung
với gen mục tiêu
Bắt cặp bổ sung không hoàn toàn gen
mục tiêu
Bắt cặp bổ sung hoàn
toàn với gen mục tiêu
(a)  siRNA bắt cặp bổ sung hoàn toàn cho vùng mã hóa của mRNA đích;
(b)  miRNA bắt cặp bổ sung với mRNA mục tiêu của nó. Sự kết hợp bổ sung thường xảy ra ở vùng hạt giống (nucleotide (nt) 2-7 ở đầu 5 ‘) của miRNA và vùng 3’ UTR của mRNA đích. Sự đa dạng của các nguồn siRNA
Các dsRNA có thể có nguồn gốc từ bên trong hoặc bên ngoài tế bào. Chúng đều bị Dicer cắt thành các đoạn dsRNA nhỏ gọi là siRNA. Các siRNA có thể có cấu trúc bắt cặp bổ sung hoàn toàn hoặc không hoàn toàn (các RNA có cấu trúc kẹp tóc, pseudogene). Các đoạn dsRNA nhỏ này đều được đưa vào con đường siRNA như đã trình bày ở các slide trước
Ở nhiều loài, các siRNA có thể được khuếch đại bởi sự hoạt động của enzym RNA- dependent RNA polymerase (RdRP) làm tăng cường và kéo dài đáp ứng im lặng
Ngoài con con đường siRNA và miRNA, ở động vật hữu nhũ có thêm con đường piRNA
a. Con đường siRNA
- Có 2 nguồn siRNA:
+ Nội bào (endo-siRNA): có nguồn gốc từ dsRNA, cấu trúc stem-loop dài bên trong nhân tế bào như pseudogene, transposon " được vận chuyển ra tế bào chất " được cắt thành các đoạn siRNA bởi Dicer-TRBP hoặc Dicer-PACT vẫn chưa được rõ(???) " được vận chuyển đến AGO2; đến AGO 1, AGO 3, AGO 4 vẫn chưa được rõ(???)
+ Ngoại bào (exo-siRNA): có nguồn gốc từ các dsRNA bên ngoài tế bào chất " được cắt thành các đoạn siRNA bởi Dicer-TRBP hoặc Dicer-PACT vẫn chưa được rõ(???) " được vận chuyển đến AGO2; AGO 1, AGO 3, AGO 4, nhưng chỉ AGO 2 có chức năng Slicer
b.  Con đường miRNA
Giống các sinh vật khác, chỉ khác: pre-miRNA được cắt bởi Dicer-TRBP hoặc Dicer- PACT, miRNA hoàn chỉnh được vận chuyển đến AGO2; AGO 1, AGO 3, AGO 4.
c.  Con đường piRNA
piRNA (24-32 nu) có nguồn gốc từ ssRNA (RNA mạch đơn)
pri-piRNA không bị cắt bởi Dicer (vai trò của Drosh chưa rõ), chúng được xử lý bởi con






Slide 22








Slide 23




Slide 24















Slide 25




Slide 26


đường “ping pong”, trong đó ARN mục tiêu của một protein Piwi bị cắt và trở thành RNA dẫn đường của một protein Piwi khác, với vai trò cắt thuộc về PIWI.
MIWI2 (một protein giống PIWI) liên kết với piRNA và định vị nó trong nhân để thực hiện chức năng im lặng của nó.

III.       Ứng dụng RNAi

Như mọi người đều biết bệnh hiện nay chủ yếu liên quan đến gen: đột biến hay gen biểu hiện bất thường. Cơ chế RNAi cho thấy chúng có thể tác động đến việc biểu hiện của các gen, nên chúng ta có thể dựa vào điều này để ứng dụng cho việc ức chế sự biểu hiện của các gen sai hỏng,
Dựa vào nguyên tắc trên chúng ta tạo ra các siRNA hay miRNA và đưa vào cơ thể người để điều chỉnh lại sự biểu hiện gen.
RNAi được ứng dụng vào rất nhiều loại bệnh trong đó có ung thư, bệnh về mắt, bệnh nhiễm, tim mạch, rối loạn biến dưỡng…
Biểu đồ về tỷ lệ các bệnh được sử dụng RNAi điều trị và đang được thử nghiệm lâm sàng (2015)
Tính chất
Các phân tử nhỏ
Thuốc protein
Thuốc siRNA/miRNA
Hoạt tính tự
nhiên
Kích hoạt hay ức chế mục
tiêu
Kích hoạt hay
ức chế mục tiêu
Ức chế mục tiêu
Vị trí nhắm
mục tiêu
Ngoại bào và nội bào
Chủ yếu là
ngoại bào
Hầu như bất kỳ vị trí
nào
Tính chọn lọc và hiệu
nghiệm
Đa dạng (dựa vào vị trí gắn và đặc hiệu thụ thể, ái lực
và hiệu quả của chúng)
Đặc hiệu cao và mạnh
Đặc hiệu cao và mạnh
Tác động
Chậm
Chậm
Nhanh chóng
Sản xuất
Dễ
Khó
Dễ
Ổn định
Ổn định
Không ổn định
Không ổn định
Phân phối
Dễ
Khó
Khó

Xây dựng thuốc RNAi

Thiết kế RNAi: lựa chọn siRNA hay miRNA.
Tăng tính bền của RNAi bằng cách thực hiện các biến đổi hóa học. Chọn phương pháp phân phối thuốc vào cơ thể.
Việc xây dựng thuốc phải giải quyết được các yêu cầu đặt ra Yêu cầu tránh việc tác động ngoài mục tiêu.
Việc lựa chọn trình tự không đặc hiệu sẽ dẫn tới việc tác động vào các gen không “chủ đích”,









Slide 27










Slide 28






Slide 29


bên cạnh đó miRNA chỉ cần bổ sung một phần để tác động đến biểu hiện gen điều này càng làm tăng khả năng tác động vào các gen khác. do đó nếu không cẩn thận do đặc tính chỉ cẩn bổ sung các hiệu ứng không mong muốn siRNA xảy ra thông qua sự bổ sung một phần của siRNA với các mục tiêu mRNA không mong muốn. Đối với siRNA tùy thuộc vào mức độ bổ sung giữa phân tử siRNA và mRNA, mRNA sẽ bị im lặng (hoàn toàn) hoặc bị ức chế một phần.
Để các siRNA, miRNA được tổng hợp bên ngoài vào được hệ tuần hoàn hoặc đến được mô đích chúng phải vượt qua được các rào cản ngoại – nội bào như:
+ Tránh bị bài tiết
+ Tránh các nuclease
+ Tránh đáp ứng miễn dịch
+ Thoát mạch
+ Tránh bị tế bào hấp thu
+ Hình thành endosome

1.    Thiết kế siRNA

Thiết kế siRNA như trên hình là một sợi đôi với các vị trí gắn Argo, TRBP như phần cơ chế có trình bày. Và chúng ta phải đảm bảo sao thiết kế siRNA không tác động ngoài mục tiêu, chúng phải bắt cặp hoàn toàn với mRNA vì nếu không siRNA có thể bắt cặp 1 phần trình tự seed như miRNA.
(1): siRNA: 19-21nu với 2 nu nhô ra ở đầu 3’: thường là TT và UU để đảm bảo cho việc Argo có thể nhận dạng nó.
(2): ta biết siRNA phải được định hướng chính xác để gắn vào RISC để sợi passenger bị loại bỏ còn sợi guide được giữ lại. Tuy nhiên cả 2 sợi này có thể được nạp vào như sợi hướng dẫn cho nên cần 2 tham số chính:
+ Quy luật bất đối xứng: Dựa vào sự ổn định nhiệt động lực học tương đối 2 đầu cuối 5’ của mạch đôi góp phần vào sự lựa chọn mạch guide nạp vào AGO. Đầu 5’ kém ổn định (A/U cao) là sợi hướng dẫn còn đầu ổn định 5’ (G/C cao) là sợi passenger
+ Ưu tiên nucleotide 5’: AGO ưa thích với mạch có một U hoặc A (ít ưa thích hơn) ở vị trí cuối đầu 5’, còn C và G sẽ là sợi hành khách
(3): tỷ lệ G/C có ảnh hưởng đến hiệu quả của siRNA vẫn còn đang tranh cãi nhưng có nhiều nghiên cứu chứng mình cho việc này.
Tác dụng ngoài mục tiêu siRNA: có thể gây chết tế bào, phổ biến nhất là hiệu quả như miRNA.
+ Điều này xảy ra khi đầu cuối 5’ của sợi guide siRNA bổ sung hoàn hảo với 3’UTR của




























Slide 30
mRNA (gợi nhớ đến việc nhận diện mục tiêu bởi vùng hạt giống miRNA)
+ siRNA chịu vài mismatches của mRNA (bắt cặp không hoàn hảo) mà không làm giảm khả năng im lặng gen. Theo TH này siRNA hoạt động như miRNA
+ Do sự bão hòa của bộ máy RNAi vì chúng sẽ cạnh tranh với miRNA nội sinh
à Để giảm điều này chúng ta sẽ:
. Sử dụng Nồng độ siRNA thấp nhất
. Kết hợp nhiều siRNA có nhiều trình tự à tuy nhiên có nghi vấn sẽ khiến nguy cơ này tăng lên hơn.
. Tránh thiết kế các trình tự hạt giống của miRNA (2 – 7nu ở cuối 5’) siRNA có thể kích hoạt miễn dịch bẩm sinh:
+ Liên quan đến đường truyền tín hiệu PRK và con đường tín hiệu TLR3. Sau này được trung gian bởi TLR 7 và TLR 8 trên các tế bào đuôi và bạch cầu đơn, các thụ thể chuyển màng tế bào. hiện diện trong endosomes của các tế bào miễn dịch à một vài trình tự kích thích miễn dịch: (5 'đến 3') "GUCCUUCAA", "UGUGU", "UGU" và "UGGC" và sự hiện diện của các chuỗi giàu U tương ứng với sự kích hoạt TLR 7/8
à Tránh các trình tự tự này hay sử dụng các tác nhân phân phối không phải phân phối nội bào siRNA hay biến đổi hóa học các trình tự này khiến chúng khôn thể nhận diện bởi TLR. Tuy nhiên các quy tắc kích thích miễn dịch bởi trình tự chưa được hiểu rõ nên cần kiểm tra cẩn thận.
Bảng tóm tắt về thiết kế siRNA

Đặc điểm
siRNA
Chiến lược
Diễn giải

Chọn lọc mạch
Áp dụng quy tắc bất đối xứng
Sử dụng ưu tiên nucleotide 5’
Mạch với một đầu kết thúc 5’ tương đối không ổn định được chọn làm mạch hướng dẫn
Mạch với U hay A ở mạch đối diện vào đầu kết thúc 5’được ưu tiên chọn là mạch
hướng dẫn

Hoạt tính
Thao tác thành phần G/C
Thành phần G/C là 30-64%
G/C trải dài >9 nu nên tránh

Hiệu quả như miRNA
Tránh trình tự tương tự miRNA
siRNAs với các trình tự khác nhau để nhắm mục tiêu cùng mRNA
kết hợp để có hiệu quả điều trị tốt.
Tránh các trình tự hạt giống của miRNA đã







Slide 31


























Slide 32






Slide 33



được xác định

Đáp ứng
miễn dịch
Tránh các motif đáp ứng
miễn dịch
Tránh trình tự giàu U và motif có chứa:
GUCCUUCAA; UGUU; UGU và UGGC

2.      Thiết kế miRNA
So với siRNA, miRNAs có một ứng dụng điều trị rộng rãi hơn. Hơn 2.500 miRNA của con người đã được ghi lại trong miRBase (phiên bản 20 truy cập vào tháng 6 năm 2015), một cơ sở dữ liệu miRNA trực tuyến có thể tìm kiếm. Vì hơn 60% gen mã hóa protein của con người chứa ít nhất một vị trí liên kết miRNA bảo tồn, cùng với sự hiện diện của nhiều vị trí không được bảo tồn, phần lớn các gen mã hóa protein nằm dưới sự kiểm soát của miRNA.29 Sự liên quan nhiều đến miRNAs trên nhiều bệnh của con người làm cho chúng trở thành các mục tiêu hấp dẫn cho các chiến lược điều trị, cũng như các dấu hiệu sinh học tiên lượng và tiên đoán. miRNAs tổng hợp (hoặc miRNA mimics) là để đạt được các chức năng sinh học giống như miRNA nội sinh. Về lý thuyết, một phân tử RNA đơn sợi có chứa chuỗi giống như sợi dẫn hướng của miRNA trưởng thành có thể được chức năng như là miRNA bắt chước. Tuy nhiên, miRNA sợi đôi có chứa cả đường dẫn hướng dẫn và hành khách đã được tìm thấy là mạnh hơn 100 đến 1.000 lần so với sợi đơn Cấu trúc đôi này có thể tạo điều kiện cho việc nạp đúng phân tử RNA vào RISC, qua đó tăng cường hiệu ứng im lặng gen
Các tiền thân miRNA tổng hợp có trình tự dài hơn (từ một số ít nucleotide tới pri-miRNA dài) cũng đã được đề xuất làm tác nhân điều trị. 78 Vì pri-miRNAs cần chế biến trong nhân, trong khi pre-miRNAs và miRNAs thì không khác nhau các chiến lược được yêu cầu cho việc phân phối các loại miRNA mimic khác nhau cho các mục tiêu tế bào.79 Tương tự như shRNA, các vec tơ virus có thể được sử dụng để biểu hiện miRNA bên trong các tế bào. Bài tổng quan này chỉ bàn về miRNAs được tổng hợp ngoại sinh.
Sự biến đổi hóa học: Vì sự biến đổi chuỗi cho miRNA điều trị có giới hạn, sự biến đổi hóa học là cách tiếp cận chính để giải quyết vấn đề này.
Một thiết kế điển hình cho miRNA, với các điểm trắng và đỏ nằm lệch ra ngoài là các mismatch, những vị trí được các nhà khoa học ghi nhận là gia tăng sự gắn và bắt của protein Argo
3.      Thay đổi cấu trúc hóa học
Phosphate 5', phần gần đầu 5’, và các vị trí trung tâm của mạch guide phản ánh các khu vực quan trọng của duplex RNA cho sự tương tác và hoạt động của các protein RISC và AGO ít chịu được sự biến đổi hóa học tại các địa điểm này.
Sự biến đổi hóa học ở toàn bộ mạch passenger và phần gần đầu 3’ và nhô ra ở đầu 3’ ít ảnh
hưởng nhất định đến tính đặc hiệu và/hoặc chức năng của RNA.





Slide 34













Slide 35







Slide 36






Slide 37


RNA dễ bị phân hủy bởi nuclease trong máu à trở ngại với thuốc siRNA và miRNA
Sử dụng chiến lược biến đổi hóa học việc này giúp tăng tính bền, còn góp phần tăng tính đặc hiệu, giảm khả năng đáp ứng và tác dụng ngoài mục tiêu.
-          Kiểu biến đổi đa dạng nhất và cũng phổ biến nhất trong thiết kế duplex RNA, do hoạt động im lặng gen của siRNAs hoặc miRNAs không phụ thuộc vào nhóm này
-          Tăng cường sự ổn định của duplex RNA trong huyết thanh.
-          Đặc biệt, thay thế bằng 2'-O-Me và 2'-F là hai sửa đổi rộng rãi nhất trong siRNA. Mặc dù những sửa đổi này nhìn chung được dung nạp tốt ở hầu hết các vị trí siRNA, việc điều chỉnh rộng hoặc đầy đủ có thể dẫn đến giảm hiệu quả của im lặng. Các thay thế 2'-O-Me và 2'-F trong siRNA được thay thế hoàn toàn, siRNA kháng nuclease và mạnh có thể được tạo ra.
-          2'-O-MOE có thể làm tăng sức đề kháng nuclease, nhưng được dung nạp kém về mặt hoạt động.

Sử dụng Locked nucleid acid hay unclocked

v    LNA:
+ Tăng đề kháng lại nuclease
+ Sửa đổi ở đầu 5’ của sợi passenger khiến nó không kết hợp với RISC
+ Ngăn cản các motif miễn dịch nhận diện bời TLR 7/8
+ Giảm hiệu quả phân giải

v  UNA:

+ Đơn UNA: Hiệu quả im lặng và tính ổn định
+ Nhiều hơn UNA, đặc biệt trong sợi Guide thì mất sự ổn định của sợi đôi, mRNA
+ UNA trong vùng hạt giống của sợi guide có thể ngăn chặn hiệu ứng tác động ngoài mục tiêu giống miRNA mà không ảnh hưởng hoạt tính siRNA

Thay đổi backbone

Việc sửa đổi PS cũng thúc đẩy sự gắn kết protein huyết tương, do đó làm giảm sự giải phóng bởi sự lọc cầu thận và bài tiết qua nước tiểu, và do đó cải thiện thành thục dược động học của nucleotide.
Kỹ thuật này đã được sử dụng thành công trong thuốc antisense PS fomivirsen , được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm chấp thuận vào cuối những năm 90.104
Tuy nhiên, tăng độc tính và giảm sự im lặng của gen cũng được quan sát. Điều này có thể bởi vì siRNAs, không giống như oligonucleotide antisense, dung nạp chỉ có giới hạn sửa đổi để duy trì sự tương thích giữa RISC. Người ta đã gợi ý rằng việc điều chỉnh PS ở trung tâm của duplex, đặc biệt là ở vị trí phosphate khan hiếm, làm suy yếu hoạt động của RISC. Do đó,















Slide 38







Slide 39


















Slide 40


một phần điều chỉnh PS đã được khuyến cáo, cùng với các kiểu sửa đổi khác để tăng cường sức đề kháng exonuclease của siRNAs.

v    Phosphorothioate

+ Được sử dụng rộng rãi
+ Tăng sức đề kháng với exonuclease
+ Sự gắn kết protein huyết tương

v    Boranophosphate

+ Có khả năng kháng nuclease và ít độc hơn so với PS
+ Có thể giữ lại hoạt tính sinh học của siRNAs vẫn cần được xác định
+ Việc áp dụng trong miRNA vẫn chưa được nghiên cứu.

4. Phân phối thuốc RNAi

Làm sao có thể đưa siRNA và miRNA có thể đi vào cơ thể và đi đến vị trí đích mà chúng ta mong muốn mà vẫn giữ nguyên hoạt tính
Có 2 chiến lược cung cấp RNAi
1.      Biểu hiện trong tế bào thông qua việc đưa các vector biểu hiện vào bằng virus
2.      Tổng hợp các RNAi và đưa trực tiếp từ bên ngoài vào
a.  Tổng hợp từ bên ngoài và có thể được sản xuất với sự biến đổi hóa học (bảng giữa) - như 2'-Omethylpurines hoặc 2'-fluoropyrimidines tăng độ ổn định. Các siRNAs Dicer-chất nền bất đối xứng cũng có thể được sản xuất (bên phải). Chúng có một đầu cùn bao gồm hai bazơ DNA (D), trong khi đầu kia có một sự mở rộng 2-nt 3 '. Điều này đảm bảo rằng một siRNA đơn được tạo ra bởi Dicer, trong đó xử lý kết thúc cùn. RNA kẹp tóc ngắn tổng hợp dài hơn (shRNAs) cũng được xử lý như chất nền Dicer.
b.  Các biểu hiện trong tế bào thông qua vector. Thúc đẩy mức biểu hiện shRNA cao từ promoter polymerase III (Pol III) (bảng điều khiển bên trái). Các RNA kẹp tóc dài (lhRNAs) tạo ra nhiều siRNA được xử lý bởi Dicer, cho thấy Dicer của động vật có vú là quá trình (M. Sano và J.J.R., những quan sát chưa được công bố). Nhiều promoter Pol III riêng biệt có thể được sử dụng trong một vector để thúc đẩy biểu hiện của một vài shRNA khác nhau (bảng giữa). Các vector mang promoter Pol II hoặc Pol III tạo ra các RNA tiền thân dài hơn, bao gồm các bản sao của shRNA polycistronic và các mô phỏng viRNA (miRNA) được xử lý bởi cả Drosha và Dicer (bên phải).
Vận chuyển siRNAs. A| Tiếp cận không chọn lọc. Các nhóm cholesterol có thể được liên kết với các RNAi bằng việc thay đổi về mặt hóa học nhỏ (siRNAs) cho hệ thống phân phối (Aa). siRNAs cũng có thể được vận chuyển một cách có hệ thống bởi các hạt lipid nucleic acid- lipid ổn định (Snalp) (Ab). B | Phương pháp chọn lọc. Aptamer-siRNA chimaeras cho phép





















Slide 41















Slide 42







Slide 43
siRNAs được chuyển đến các loại tế bào cụ thể biểu hiện thụ thể được ghi nhận bởi aptamers (Ba và Bb). Một phương pháp tiếp cận mà tất cả RNA có thể được sử dụng là ghép aptamers và siRNAs (Ba), hoặc dùng biotin-streptavidin để hợp lại (Bb). Các đoạn chuỗi nặng kháng thể (Fabs) và siRNAs có thể liên kết với protamine để phân phối siRNA tới các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào (Bc). Các hạt nano hiển thị các ligand đặc hiệu trên bề mặt của chúng được sử dụng để nhắm mục tiêu các siRNA tới các loại tế bào đặc biệt (Bd). PEG, polyethylene glycol.
Các vector có nguồn gốc từ adenoviruses hoặc AAVs được sử dụng để biểu hiện ngắn hơn các shRNAs trong các chiến lược điều trị chống lại bệnh ung thư và các bệnh khác, khi không đòi hỏi RNAi dài hạn. Những vector không tích hợp này phần lớn vẫn còn nguyên vẹn, tích hợp ở tần số thấp, và truyền tải ở cả tế bào phân chia và không phân chia với transgenes shRNA điều trị (hình 6). Một trở ngại có thể có đối với các vector dựa trên adenovirus và AAV là quản lý (administrations) lặp đi lặp lại có thể gây ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ, do đó có khả năng giới hạn hiệu quả của chúng trong các thiết lập điều trị nhất định.
Vận chuyển RNAi không dùng virus
Vận chuyển
Phương pháp                             Ưu điểm                                         Khuyết điểm nucleic acid
Cholesterol         siRNA            Vận chuyển hệ thống, ổn định       Không chọn lọc SNALP         siRNA             Vận chuyển hệ thống, rất ổn định Không chọn lọc Fab                    siRNA             Vận chuyển tới thụ thể đặc hiệu Xây dựng tương
đối phức tạp
Aptamer            siRNA             Vận chuyển tới thụ thể đặc hiệu Cần phải kiểm tra
trình tự quy mô lớn
Nanoparticle      siRNA            Vận chuyển tới thụ thể đặc hiệu, Chuẩn bị tinh vi
tự tập hợp
Phân phối shRNA bằng virus. Vectơ lentivirus được sử dụng để cung cấp các liệu pháp phân phối, gen biểu hiện RNA kẹp tóc ngắn (shRNA) được chuyển gen và tích hợp vào bộ genonme để biểu hiện shRNA ổn định. Vector adenovirus và liên qua adenovirus (VAA) không thành công trong việc tích hợp các gen chuyển vào genome nhưng thay vào đó biểu hiện các shRNA episomally cho mức độ biểu hiện shRNA ổn định vừa phải, cảm ứng phức hợp RISC (RNA-induced silencing complex).
Vận chuyển RNAi dùng virus

Phương pháp
Vận chuyển
Ưu điểm
Khuyết điểm






























 















Slide 44














Slide 45















Slide 46


nucleic acid


Lentivirus
RNA (sản phẩm
shRNA)
Biểu hiện ổn định, truyền vào
các tế bào không phân chia
Rủi ro phá vỡ gen,
phân phối cục bộ
Adenovirus
dsRNA (sản phẩm shRNA)
Episome, không có đột biến chèn
Gây đáp ứng miễn dịch, nhiễm độc gan
phụ thuộc vào liều
AAV
ss/dsRNA (sản phẩm shRNA)
Episome, tích hợp gen thấp
Gây đáp ứng miễn dịch, chỉ có thể
mang vector nhỏ.
IV.       Ví dụ về thuốc nhắm mục tiêu RNAi
Khoảng những năm 2011, sử dụng interferon và ribavidin -> chỉ khoảng 50% cho đáp ứng lâu dài về việc kháng virus, chủ yếu ở genotype 1
Sau đó phát triển các thuốc tác động trực tiếp vào virus, cụ thể là thuốc phân tử nhỏ, nhắm mục tiêu vào các protein đặc trưng của HCV và hạn chế được tối thiểu tác dụng phụ và đã được FDA cho phép sử dụng. Có 2 hướng, một là nhắm tới các enzyme cần thiết để virus nhân bản là protease NS3-4A và polymerase NS5B. Một hướng khác nhắm tới NS5A của việc lắp ráp virus hoàn chỉnh, nhóm cuối cùng ức chế hoạt động của NS5B polymerase. Các thuốc này cho đáp ứng kháng virus lâu dài tới 95% tuy nhiên cũng chỉ cho tác dụng ở phenotype 1. tập trung vào miR-122, sử dụng oligonucleotide gọi là antagomiR giúp knock down miRNA.
Cần loại thuốc bao phủ hết các genotype HCV và đạt hiệu quả điều trị lâu dài.
Chu kỳ sống của HCV
HCV xâm nhập vào tế bào sẽ giải phóng RNA virus RNA ((+) RNA, đỏ) vào tế bào chất. RNA (+) muốn hình thành virion mới trước hết phải tương tác với ribosome trong mạng lưới nội chất (ER) để trải qua quá trình dịch mã tạo ra các protein cần thiết cho việc lắp ráp các phức hợp nhân bản, các protein này kết hợp với các protein có sẵn từ ER hình thành nên màng tế bào. Bên cạnh đó cũng có sự tổng hợp RNA (-) từ sợi RNA (+), và sợi RNA (-) sẽ làm khuôn tổng hợp nhiều sợi RNA (+) mới. Những phân tử RNA (+) mới này có thể được sử dụng tiếp tục để dịch mã tạo ra các protein. Làm khuôn tổng hợp sợi (-) hay được đóng gói thành các viron mới, một số chúng có thể bị phân hủy trong tế bào ví dụ như bị phân hủy bởi 5'-3 'exoribonuclease 1 (XRN1)
Hai quá trình dịch mã (trái) và phiên mã (phải) không được diễn ra cũng một lúc.
Vai trò miR122 trong chu kỳ sống của HCV
Theo giả thuyết, có sự điều chỉnh cân bằng giữa dịch mã và tổng hợp RNA. Chu kỳ của HCV



















Slide 47




Slide 48

















Slide 49


dạng genome vòng chưa được biết rõ, nhưng người ta thấy poly(rC)-binding protein 2 (PCBP2) đóng một vai trò quan trọng. Hình này mô tả microRNA miR-122 và PCBP2 cùng điều chỉnh vòng genome HCV và do đó ảnh hưởng đến sự tham gia của RNA trong các quá trình tổng hợp và dịch mã không cùng lúc với nhau.
PCB2 hỗ trợ cho vị trí gắn của ribosome (IRES), tạo điều kiện cho việc dịch mã bắt đầu từ vị trí IRES theo ciều 5’ – 3’và tăng cường việc tái sử dụng tiêu đơn vị 40S sau khi hoàn thành một vòng dịch mã.
miR-122 cạnh tranh với PCBP2 gắn kêt vào vùng 5’UTR thúc đẩy sự mở vòng, miR-122 cũng có thể gây ra những thay đổi trong cấu trúc của IRES. Dẫn đến hỗ trợ tăng cường tổng hợp RNA (-) và tắt việc dịch mã, có thể do vùng đã mở 3’UTR cho sự tương tác, sao chép RNA. miR-122 hoạt động liên kết vớ AGO2 bảo vệ đầu 5’ của genome khỏi sự phân cắt của exoribonuclease 1 5’-3’ (XRN1).
Hình bên trái cho thấy vùng trình tự gắn kết giữa miR-122 và đầu 5’UTR của RNA HCV

Cơ chế của Miravirsen

Miravirsen bắt đặt hiệu miR-122 dẫn đến ngăn cản việc gắn kết của miR-122 lên RNA của HCV. Từ đó ức chế việc sinh tổng hợp mạch mới của genome HCV, bất hoạt sự nhân lên của virus HCV.

Thiết kế trình tự ức chế miR-122

1.  Vùng mục tiêu là đầu 3’ của miR-122 vì tầm quan trọng của vùng này bắt cặp với genome HCV, lựa chọn được oligonucleotides bổ sung với vùng này và có kích thước 13 – 16 mer với nhiệt độ nóng chảy ít nhất 60oC.. Sử dụng các locked nucleic acid để tăng tính bền và tính đặc hiệu.
2.  Loại trừ các nucleotide bổ sung cho các nucleotide đầu tiên miR-122 vì những nu này liên kết với pro Argonaute và tránh sự bắt đặc hiệu ở vùng seed sẽ gây ra các đáp ứng ngoài mục tiêu.
3.  Để ngăn chặn khả năng cắt của antimiR bởi phức hợp RISC, sửa đổi hóa học tại vị trí phân cắt sợi sense (passenger).
4.  Cuối cùng, để tăng cường tính chất dược động học và cải thiện khả năng kháng nuclease, tất cả các antimiR được tổng hợp với một backbone PS hoàn chỉnh và ưu tiên với sự biến đổi ở đầu 5’ và 3’.
Chọn lọc các antimiR (Elmén et al., 2008)
Với 9 đoạn oligonucleotide được thiết kế và có độ dài khác nhau thực hiện sàng lọc để chọn được mạch tối ưu nhất
Thực hiện clone vị trí gắn kết hoàn chỉnh với miR-122 ở 3’UTR của Renilla luciferase






Slide 50











Slide 51



















Slide 52


reporter gene, sau đó đưa vào tế bào gan người Huh-7. Phân tích khả năng gắn kết đặc hiệu với miR-122 của các oligonucleotide (5nm) thông qua mức độ huỳnh quang và kết quả cho thấy, một đoạn 15-mer gọi là SPC3649 (miravirsen) có nhiệt độ nóng chảy 80 độ cho ái lực cao, ức chế miR-122 mạnh với nồng độ thấp.
So sánh khả năng ức chế sự sao chép HCV trong các tế bào Huh-7 có chứa replion HCV NNeo/C-5B. Các oligonucleotides LNA-antimiR khác nhau với khả năng gắn kết đặc hiệu và nhiệt độ nóng chảy từ thấp đến cao, cùng một oligonucleotide 2'-O-methyl (2'-OMe) bổ sung hoàn toàn (từ Jopling et al. ).
Kết quả cho thấy đoạn LNA-L9 ức chế sự sao chép HCV tốt nhất tương ứng với nồng độ replicon HCV thấp nhất. L6 đứng thứ 2 và cuối cùng là L4, kết quả này tương đồng với kết quả gắn kết đặc hiệu với miR-122 ở thí nghiệm trên.
Thử nghiệm tương tự với 2'-Ome, LNA-L9 và đoạn LNA-L9 có mismatch và kết quả cũng cho thấy L9 có sự ức chế sao chép HCV.

Thử nghiệm trên động vật nhỏ - chuột (Elmén et al., 2008)

miR-122 có vai trò trong quan trọng quá trình sinh tổng hợp cholesterol ở gan và huyết thanh, tác động vào quá trình oxy hóa axit béo, miR-122 cũng có tính kháng viêm và chống hình thành khối u. Vì vậy cần phải xem xét việc ức chế miR-122 có ảnh hưởng đến chức năng sinh học của miR-122 trong vật chủ hay không.
1.       Thử nghiệm trên chuột với các đoạn L4 và L9 với các nồng độ 1, 5, 25 mg/kg
Kết quả northern blot cho thấy đoạn L9 bắt đặc hiệu với miR-122 tốt nhất tương ứng với vạch miR-122 nhạt dần và tăng ở vạch mạch đôi. Nồng độ cholesterol trong máu giảm khi đưa L4, L9 vào chuột và mức giảm không đáng kể. AldoA và Bckdk càng cao thể hiện gan bị thương tổn càng nhiều. L9 thể hiện mức giảm AldoA và Bckdk cao khi sử dụng với nồng độ càng tăng, cho thấy sử dụng các antimiR không gây ảnh hưởng tới gan.
2.       Thử nghiệm tương tự nhưng sử dụng đoạn L9 và một antagomir từ báo cáo trước. Kết quả cũng cho thấy L9 có hiệu quả cao trong việc bắt đặc hiệu với miR-122 và không ảnh hưởng nhiều tới chức năng của miR-122 trong sinh tổng hợp cholesterol (nồng độ cholesterol trong máu không có ảnh hưởng lớn), cũng như là đối với AldoA và Bckdk.

Thử nghiệm trên động vật lớn – tinh tinh (Lanford et al., 2010)

Thử nghiệm với liều cao 5mg/kg với nồng độ HCV ban đầu khoảng từ 105106 Thử nghiệm với liều cao 1mg/kg với nồng độ HCV ban đầu khoảng từ 104 105
Không thấy các phản ứng phụ ở động vật được điều trị. Điều quan trọng không phát hiện sự gia tăng virus trong giai đoạn điều trị 12 tuần.
Kiểm tra virus có những thay đổi dẫn đến kháng thuốc khi điều trị với miravisen. Thực hiện






Slide 53







Slide 54






Slide 55










Slide 57


phân tích trình tự vị trí bắt cặp miR-122 ở vủng 5’UTR của RNA HCV trong các giai đoạn ban đầu, kết thúc điều trị, khi virus tái phát trở lại và kết thúc theo dõi. Kết quả cho thấy không có đột biến thích nghi ở hai vị trí lai miR-122 và 5’UTR, cho thấy vùng này có tính bảo tồn cao và miravirsen có rào cản cao đối với khả năng kháng virus.
Khả năng sử dụng cho tất cả các genotype
Lanford et al., 2010, so sánh vùng trình tự của hai vị trí lai giữa HCV 5’UTR và miR-122 ở tất cả các genotype HCV cho thấy vùng trình tự này tương đồng bảo tồn giữa các genotype HCV.
Năm 2011, Li et al thực hiện và xác nhận hai vùng trình tự này tương đồng giữa các genotype HCV.

Khả năng gắn kết của miravirsen

Miravirsen (SPC3649) gắn kết ức chế hoạt động của miR-122. Pri-miR-122 được xử lý bởi Drosha để hình thành pre-miR-122, sau đó lần lượt được xử lý bởi Dicer và gắn kết miRISC. Miravirsen (SPC3649) có khả năng gắn kết vào cấu trúc vòng lặp gốc của pri-miRNA cũng như pre-miRNA, và cũng có thể gắn kết với miRNA trưởng thành.

Vận chuyển – Phân phối Miravirsen

Các oligonucleotide LNA thường sử dụng các hạt nhỏ để vận chuyển
Chiến lược vận chuyển của miravirsen không được tìm thấy tuy nhiên nó có thể giống với cơ chế vận chuyển của một thuốc RNAi cũng nhắm trúng đích tới gan như sau:
Các hạt lipid được phủ ligand với các thụ thể ApoE trong tế bào gan và được nhập bào. Các hạt lipid này sẽ được tích điện tích dương do pH axit của túi nội bào. Các hạt nano tích điện dương sẽ liên kết với màng nội bào tích điện tích âm dẫn đến sự dung hợp của các màng cuối cùng sẽ giải phóng siRNA vào bào tương tế bào.

Trả lời câu hỏi RNAi bị điều hòa bởi yếu tố nào?

Cảm ứng biểu hiện RNAi
Cơ chế tế bào phát hiện ss/ds RNA của virus tùy thuộc vào loại tế bào.
Đối với tế bào không phải tế bào miễn dịch (ở bên trái) phát hiện các oligonucleotide virus nhờ RIG-I (đối với RNA 5’triphosphate) và MDA-5 (đối với dsDNA) và được điều hòa bởi LGP2. CARDIF kích hoạt sự kích hoạt của RIG-I, kết quả là kích hoạt các yếu tố phiên mã. Đối với tế bào miễn dịch (ở bên phải) nhận diện ss/ds RNA bởi TLR. Thông qua kích hoạt và thu hút các adaptor (TRIF và MyD88), TRL3, 7 và 8 kích hoạt IRFs và các yếu tố phiên mã NF-κB.
=> Các nhân tố phiên mã này tạo ra sự biểu hiện của IFN và cytokine gây viêm. Song song đó, phiên mã tạo các dsRNA nội sinh từ đó hình thành pri-miRNA, pre-miRNA và cuối cùng



Slide 58
là miRNA
Ức chế con đường RNAi
Virus mã hoá các protein chuyên dụng để chống lại RNAi.
Sự nhân đôi của virus dễ bị tấn công bởi RNAi, vì các dsRNA xuất hiện trong quá trình nhân đôi của virus có thể bị nhận biết bởi Dicer. Do đó, virus mã hóa các protein chống lại RNAi để bảo vệ RNA virus không bị phân hủy. Các protein này can thiệp vào con đường RNAi trong tế bào vật chủ, như gắn vào phức hợp protein cắt dsRNA (Dicer), gắn vào dsRNA hoặc siRNA, ngăn cản việc lắp ráp phức hợp cảm ứng im lặng gen (AGO-containing silencing complex), ức chế việc tạo thành siRNA.
Các virus RNA và DNA xâm nhiễm vào thực vật, côn trùng, cá hoặc động vật biến nhiệt mã hóa các enzym RNaseIII Class1 (giống protein endonuclease). Hoạt tính enzyme endonuclease đặc hiệu dsRNA (RNaseIII) của iridovirus trong cá tráp (rock bream) xâm nhiễm cá và Sweet potato chlorotic stunt crinivirus (SPCSV) xâm nhiễm thực vật đã biết. Sự ức chế con đường RNAi chống lại virus của vật chủ của RNaseIII ở SPCSV và virus Heliothis virescens ascovirus xâm nhiễm côn trùng đã được chứng minh. Ức chế RNAi của các enzym RNaseIII Class1 virus trong các sinh vật không phải vật chủ vẫn chưa được tìm hiểu.
PPR3, một enzym RNaseIII của Pike-perch iridovirus, ức chế RNAi trong các loài không phải vật chủ như Nicotiana benthamiana (thực vật) và Caenorhabditis elegans (tuyến trùng). Sự ức chế RNAi bị suy giảm khi hoạt tính xúc tác của PPR3 bị giảm.
Enzym RNaseIII (CSR3) của SPCSV không ức chế được RNAi (cảm ứng bởi ssRNA) trong C.elegans. Trong lá N. benthamiana, PPR3 ức chế RNAi cảm ứng bởi dsRNA và ssRNA, và đảo ngược được sự im lặng gen; nhưng CSR3 chỉ ức chế RNAi cảm ứng bởi ssRNA và không đảo ngược được sự im lặng gen.
Cả PPR3 cà CSR3 đều không ức chế được RNAi trong Drosophila melanogaster.
Những kết quả này cho thấy các enzym RNaseIII của RNA và DNA virus ức chế RNAi phải có hoạt tính xúc tác. Khác với các protein virus ức chế sự im lặng gen, các enzyme RNaseIII tương đồng trong các virus RNA và DNA không liên quan và có thể được phát hiện trong bộ gen virus bằng cách sử dụng các chương trình dự bóa sự biến đổi gen và cấu trúc protein.
TLTK: Suppression of RNAi by dsRNA-Degrading RNaseIII Enzymes of Viruses in Animals and Plants
(http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1004711#sec006)


COMMENTS

Tên

5 vận may,36,Acetaminophen,1,ADR,1,APK Y DƯỢC,2,benh-hoc,13,benh-hoc-va-phac-do,25,benh-va-suc-khoe,9,Béo phì,1,bệnh Dại,1,bú mẹ,2,Ca lâm sàng,1,Cảnh giác Dược,6,canh-giac-thuoc,9,Cao Học CNSH,7,Cẩm Nang,1,Cân Nặng,1,Cấp cứu,3,Celecoxib,1,chan-thuong,1,Chấn Thương,2,Chọn hướng kê bàn,39,Chuyện nghề,1,cnsh,2,Corticosteroid,1,Công Nghệ Sinh Học,4,Công Nghiệp Dược,1,Công ty Dược,1,Creatinin,1,Da Liễu,1,da-lieu,1,Dạy con nên người,3,Dâu tằm Vọng Nguyệt,1,dậy thì,1,Dị ứng,3,Diazepam,1,dinh dưỡng,25,don-on,4,don-tai-mui-hong,2,don-viem-vui,1,don-viem-xoang,1,dong-y,4,duoc-ly-hoc,1,Dược điều trị,4,Dược Hà Nội,4,Dược Khoa,60,Dược lâm sàng,6,Dược sĩ tư vấn,5,Dược thế giới,1,Dược Việt Nam,3,Đái dầm,3,giai-phau,9,gpp,2,hen-phe-quan,1,Hissamitsu,1,Ho,1,hoi-dap,3,home,1,Hô hấp,8,Huyết học,6,HƯỚNG DẪN TẢI FILE,2,Hướng nghiệp Dược,2,Kết nối Dược sĩ,7,Kháng sinh,1,khang-sinh,6,Khoa Học Tự Nhiên,1,khong-dung-thuoc,1,Kiến thức chuyên ngành,19,KINH NGUYỆT,1,kinh-doanh-duoc-pham,10,LÀM ĐẸP,2,LÂM SÀNG,2,lieu-thuoc,1,LIÊN THÔNG,1,Marketing Dược,2,mat,2,Mắt,7,Mẹo Nhớ Tên Thuốc,2,Môn Anh Văn Chuyên Ngành Dược,1,Môn Bào Chế,1,Môn Bệnh Học,1,Môn Chuyên Ngành,25,Môn CNSH Dược,1,Môn CNTT Dược,1,Môn Cơ Sở,31,Môn Dịch Tễ,1,Môn Dược Cổ Truyền,1,Môn Dược Động,1,Môn Dược Lâm Sàng,3,Môn Dược Liệu,2,Môn Dược Lý,1,Môn Dược Xã Hội,1,Môn Giải Phẫu,1,Môn Hóa Dược,2,Môn Hóa Đại Cương Vô Cơ,2,Môn Hóa Hữu Cơ,1,Môn Hóa Lý,2,Môn Hóa Phân Tích,4,Môn Hóa Sinh,3,Môn Kiểm Nghiệm,9,Môn Kinh Tế Dược,2,Môn Ký Sinh Trùng,1,Môn Môi Trường,1,Môn Pháp Chế Dược,1,Môn Sinh Học,1,Môn Sinh Học Phân Tử,1,Môn Sinh Học Tế Bào,2,Môn Sinh Lý,1,Môn Sinh Lý Bệnh Miễn Dịch,1,Môn Sức Khỏe Môi Trường,1,Môn Thực Vật Dược 1,1,Môn Thực Vật Dược 2,3,Môn Vi Sinh,1,nghiencuuthuoc,9,Ngoại khoa,2,Ngôn ngữ,6,nhi,2,Nhi khoa,27,nhi-khoa,5,Nhiễm Trùng,1,noi-khoa,1,NSAIDs,1,Ôn Tốt Nghiệp,1,phac-do,2,phac-do-tieu-hoa,2,phan-tich-don-thuoc,25,Phát triển,3,Phân tích đơn thuốc,1,phong,1,Phong thủy,152,Phong thủy 2015,16,Phong thủy 2016,14,Phong thủy 2017,29,Phong thủy 2018,25,phong thủy tình yêu,12,PHỤ NỮ,1,quan-ly-duoc,11,rang-ham-mat,1,Rifampin,1,sach-tai-lieu,21,Salbutamol,1,Salonpas,1,san-khoa,1,Sinh Dược Học,10,Sop nha thuoc,1,Sống đẹp,3,sơ cứu,4,Sơ sinh,2,Sởi,7,su-dung-thuoc,11,Suy thận,3,Sử dụng thuốc,13,sữa mẹ,14,TA,1,Tài liệu Dược,1,Tai mũi họng,5,tai-lieu-tong-hop,4,tai-mui-hong,14,tai-mũi-họng,3,TAILIEUCLB,1,Táo bón,4,tay-y,6,Tâm lý,16,Thalassemia,6,than-kinh,2,Thong-tin-y-hoc,52,Thông tin thuốc,9,Thông tin y học,2,Thuốc,5,Thuốc Đông y,1,Thuốc hạ đường huyết,3,Thuốc mới,2,Thuốc tránh thai,1,tieng anh,1,tieu-hoa,3,Tiêm chủng,3,Tiết niệu,3,Tiêu hóa,6,tim-mach,1,Tin Tức,24,tin-hoc,1,tin-moi,19,toa-BHYT,1,tong-hop,1,triet-hoc,1,Trình dược viên,1,trung-dich,1,Truyền nhiễm,13,Tử vi theo tháng,55,Ung thư,6,Uốn ván,1,Vaccin,3,Vận may con giáp,31,Viagra,1,viem-da-day,1,viem-da-day-hp,1,viem-hong-man-tinh,1,viem-mui,3,viem-mui-cap,3,viem-mui-di-ung,1,viem-xoang-cap,1,Viêm nào Nhật Bản,1,virus Dại,1,Vitamin,1,Vitamin B12,1,Warfarin,1,XÉT NGHIỆM,1,xuong-khop,1,Y Dược 24/7,6,y-hoc,5,y-hoc-co-so,2,
ltr
item
Cộng đồng Dược Việt Nam: Cơ chế RNAi; ứng dụng RNAi trong điều trị bệnh và thuốc RNAi
Cơ chế RNAi; ứng dụng RNAi trong điều trị bệnh và thuốc RNAi
https://1.bp.blogspot.com/-fLSjhZMq6v4/Ws7dI5_jUnI/AAAAAAAABzo/_xBSFCgANXg9WaV-TLSp8_aDIdphWXE_gCLcBGAs/s320/Untitled.png
https://1.bp.blogspot.com/-fLSjhZMq6v4/Ws7dI5_jUnI/AAAAAAAABzo/_xBSFCgANXg9WaV-TLSp8_aDIdphWXE_gCLcBGAs/s72-c/Untitled.png
Cộng đồng Dược Việt Nam
https://www.pharmaviet.com/2017/11/co-che-rnai-ung-dung-rnai-trong-ieu-tri.html
https://www.pharmaviet.com/
https://www.pharmaviet.com/
https://www.pharmaviet.com/2017/11/co-che-rnai-ung-dung-rnai-trong-ieu-tri.html
true
3796296470398065570
UTF-8
Loaded All Posts Not found any posts VIEW ALL Readmore Reply Cancel reply Delete By Home PAGES POSTS View All RECOMMENDED FOR YOU LABEL ARCHIVE SEARCH ALL POSTS Not found any post match with your request Back Home Sunday Monday Tuesday Wednesday Thursday Friday Saturday Sun Mon Tue Wed Thu Fri Sat January February March April May June July August September October November December Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec just now 1 minute ago $$1$$ minutes ago 1 hour ago $$1$$ hours ago Yesterday $$1$$ days ago $$1$$ weeks ago more than 5 weeks ago Followers Follow THIS CONTENT IS PREMIUM Please share to unlock Copy All Code Select All Code All codes were copied to your clipboard Can not copy the codes / texts, please press [CTRL]+[C] (or CMD+C with Mac) to copy